Influenza virus A/B (вирусы гриппа А/В), РНК [реал-тайм ПЦР]

Выявление вируса гриппа серотипов А и В (Influenza virus A/B), в ходе которого с помощью метода полимеразной цепной реакции в реальном времени (РТ-ПЦР) определяется генетический материал (РНК) вируса в образце биоматериала.

Синонимы русские

Грипп А/В.

Синонимы английские

Influenza serotypes A/B, RNA [real-time polymerase chain reaction, RT-PCR, quantitative RT-PCR, qPCR, qRT-PCR].

Метод исследования

Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Мазок из зева (ротоглотки) и носа, мокроту.

Как правильно подготовиться к исследованию?

• Рекомендуется употребить большой объем жидкости (воды) за 8-12 часов до сбора мокроты.
• Не принимать пищу, не пить и не полоскать горло в течение 2-3 часов до исследования.
• За 3-4 часа до взятия мазков из ротоглотки (зева) и носа не употреблять пищу, не пить, не чистить зубы, не полоскать рот/горло, не закапывать капли/спреи в нос, не жевать жевательную резинку, не курить. Взятие мазков оптимально выполнять утром, сразу после ночного сна.

Общая информация об исследовании

Influenza virus (вирус гриппа) – это оболочечный вирус, характеризующийся наличием сегментированного негативного РНК-генома и нуклеокапсида в форме спирали. Он относится к семейству Orthomixoviridae. На основании структурных различий нуклеопротеида выделяют 3 серотипа Influenza: A, B и С. Серотип A встречается как людей, так и у животных, в то время как варианты B и C поражают преимущественно людей. Именно серотип А ответственен за подавляющее большинство случаев сезонных (эпидемических) и пандемических вспышек гриппа.

Идентификация вируса гриппа должна быть осуществлена в кратчайшие сроки, что связано с высокой заразностью этого заболевания. Кроме того, эффективность противовирусных препаратов максимальна при их назначении в первые 48 часов после инфицирования, что также диктует необходимость своевременной постановки окончательного диагноза. Среди многих "быстрых" диагностических тестов особое место занимает полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (РТ-ПЦР). Полимеразная цепная реакция в реальном времени (РТ-ПЦР) – это метод молекулярной диагностики, позволяющий выявлять в биологическом материале (например, в мокроте) фрагменты генетического материала (РНК) возбудителя инфекции. Благодаря высокой чувствительности и специфичности метода, а также возможности получить результат в наболее короткие сроки, РТ-ПЦР заменила другие, применяемые ранее, методы диагностики гриппа: выделение вируса в культуре клеток, а также серологические исследования и иммуноферментный анализ.

Многие прямые лабораторные тесты, разработанные для идентификации Influenza, основаны на выявлении белковых компонентов наружной оболочки вируса: гемагглютинина (H) и нейраминидазы (N). Эти белки являются основными факторами, определяющими степень болезнетворности вируса, а также используются для диагностики и классификации выявляемого вируса гриппа. Они обладают выраженной изменчивостью (известно 16 разновидностей N и 9 разновидностей H серотипа Influenza A), что вызывает ежегодные сезонные вспышки гриппа), а также создает определенные трудности при идентификации вируса гриппа с помощью этих методов. Структурное разнообразие антигенов H и N приводит к тому, что чувствительность большинства прямых лабораторных тестов (таких как прямая иммунофлюоресценция и ELISA) составляет около 65-75 %. Исследование РТ-ПЦР основано на выявлении консервативной последовательности ДНК, общей для разных штаммов вируса гриппа серотипов А и В, что обуславливает максимальную чувствительность этого теста (98-100  %).

В отличие от других тестов, чувствительность исследования РТ-ПЦР практически не изменяется при взятии материала на фоне начатой терапии противовирусными препаратами. Это связано с тем, что в реакции выявляется не сам вирусный агент, а фрагмент вирусной ДНК. По этой же причине положительный результат исследования не всегда указывает на наличие живого вируса (репликацию) и не всегда означает, что пациент остается заразным для окружающих.

В отличие от других лабораторных тестов (в первую очередь, экспресс-тестов для определения антигена вируса гриппа), результат РТ-ПЦР в меньшей степени зависит от распространенности гриппа среди населения. РТ-ПЦР характеризуется редкими ложноположительными и ложноотрицательными результатами как во время эпидемии, так и в период низкой заболеваемости гриппом.

Идентификация вируса гриппа с помощью РТ-ПЦР возможна в течение более длительного времени от начала заболевания по сравнению с большинством других тестов. Тем не менее взятие отделяемого носо/ротоглотки для исследования с помощью РТ-ПЦР должно быть произведено не позднее чем через 72-96 часов (оптимально в первые 48-72 часа). Это связано с тем, что интенсивная репликация Influenza при поражении верхних дыхательных путей происходит в течение первых 4 суток заболевания. У пациентов с вовлечением нижних отделов дыхательных путей вирусная нагрузка сохраняется высокой более длительный период. Исследование отделяемого носоглотки и мокроты дает лучшие результаты по сравнению с исследованием отделяемого ротоглотки.

При обследовании пациента с клиническими признаками Influenza-ассоциированной инфекции верхних дыхательных путей следует выполнить анализ отделяемого носо/ротоглотки. При обследовании пациента с признаками Influenza-ассоциированной инфекции нижних дыхательных путей анализ мазков из зева и носа необходимо дополнить исследованием мокроты. Исследование мокроты также должно быть осуществлено при отрицательном результате, который дал анализ отделяемого верхних дыхательных путей у пациента с клиническими признаками гриппа. Следует повторить РТ-ПЦР при отрицательном результате исследования мокроты у пациента с клиническими признаками Influenza-ассоциированной инфекции нижних дыхательных путей.

Для более точной диагностики Influenza рекомендуется сочетание РТ-ПЦР с дополнительными общеклиническими исследованиями. Кроме того, необходимо исключить бактериальную суперинфекцию.

Для чего используется исследование?

• Для диагностики гриппа.

Когда назначается исследование?

При симптомах:

• острой респираторной вирусной инфекции (внезапное острое начало болезни, лихорадка, боль в горле, боль в мышцах,  головная боль, светобоязнь, сухой  кашель, боль в грудной клетке, одышка);
• острой энцефалопатии в период эпидемии гриппа (судороги, атаксия, нарушение сознания).

Что означают результаты?

Референсные значения: отрицательно.

Причины положительного результата:

• Influenza-ассоциированная инфекция.

Причины отрицательного результата:

• отсутствие Influenza-ассоциированной инфекции.

Важные замечания

• Положительный результат исследования не означает, что пациент остается заразным для окружающих.
• Анализ не позволяет выявлять Influenza серотипа С.

Также рекомендуется

• Клинический анализ крови: общий анализ, лейкоцитарная формула, СОЭ (с микроскопией мазка крови при выявлении патологических изменений)
• Mycoplasma pneumoniae, ДНК [реал-тайм ПЦР]
• Adenovirus, ДНК [реал-тайм ПЦР]
• Streptococcus pneumoniae, ДНК [реал-тайм ПЦР]

Кто назначает исследование?

Инфекционист, педиатр, врач общей практики, анестезиолог-реаниматолог.

Литература

• Kamps B. S, Hoffmann C, Preiser W. Influenza Report 2006 / B. S. Kamps, С. Hoffmann, W. Preiser W. – Flying Publisher, 2006.
• Wang R, Taubenberger JK. Methods for molecular surveillance of influenza. Expert Rev Anti Infect Ther. 2010 May;8(5):517-27.
• Schuchat A, Bell BP, Redd SC. The science behind preparing and responding to pandemic influenza: the lessons and limits of science. Clin Infect Dis. 2011 Jan 1;52 Suppl 1:S8-12.
• Pregliasco F, Mensi C, Camorali L, Anselmi G. Comparison of RT-PCR with other diagnostic assays for rapid detection of influenza viruses. J Med Virol. 1998 Oct;56(2):168-73.
• WHO Global Influenza Surveillance Network. Manual for the laboratory diagnosis and virological surveillance of influenza. – World Health Organization, 2011.